유전공학 實驗 - PCR과 Transformation
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작성일 23-01-18 22:48
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PCR tube에는 라벨링을 한다.
4) 칼슘을 처리한 박테리아가 해동될 때 까지 얼음에 보관하고 이후 조심스럽게 세포를 reaction 튜브 안으로 주입한다.
① 튜브에 DNA template 1㎕, FW primer 2㎕, RV primer 2㎕, DW 15㎕를 넣으려고 하였으나 실패의 가능성이 있으므로 각각 2배의 양으로 한다.
▶ PCR tube 속에 있는 파란 물질은 염색을 하기 위한 용도로 전기영동 시에 홈에 주입하였는지 확인을 더 쉽게 할 수 있따③ 94℃에서 2분 동안 진행하고 94℃에서 30초, 58℃에서 30초, 72℃에서 1분 30초로 한 cycle을 설정하여 35cycle을 진행한다.
② 아래쪽에 필터링 된 물질을 pipette으로 제거한 후 buffer NW를 700㎕ 추가한 후에 30초 동안 원심분리 한다. 원심분리 후에는 필터링 된 물질을 제거한다.
3) 2X Rapid Ligation Buffer - 5 ㎕, pGEM-T Easy Vector (50 ng) - 1 ㎕, PCR product - 3 ㎕, T4 DNA Ligase - 1 ㎕로 총 10㎕를 튜브에 넣고 이 튜브를 1시간 동안 실온에 보관한다.
9) transformation된 산물을 인큐베이터 안에서 plate에 도말하여 하루 밤이 지나면 觀察(관찰) 한다.
④ 30㎕의 buffer EB를 넣고 1분 동안 원심분리를 한다.
⑤ 1.5ml tube에 있는 물질이 정제된 PCR산물.
⑥ 2㎕을 전기영동한다.
③ 1분 동안 추가적으로 원심분리를 하고난 후에 새로운 1.5ml tube로 column을 옮긴다.
5) 튜브를 얼음에 30초 동안 보관한다,
6) 42℃의 물에 90초 동안 놔두었다가 이후 즉시 2분간 얼음에 다시 놔둔다. 그런 후 4℃에서 보관한다. ▶ 실제 觀察(관찰) 은 實驗(실험)이 끝난 후 5일 뒤 觀察(관찰) .
4. Results
1) 전기영동 확인 결과
2) transformation 확인
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유전공학 實驗 - PCR과 Transformation
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